Modificazioni del fenotipo e dell'espressione genica in semenzali di arancio amaro inoculati con Citrus tristeza virus.

Abstract

La tristeza degli agrumi, causata da Citrus tristeza virus (CTV) e' uno dei fattori limitanti l'agrumicoltura mondiale. Nonostante il considerevole impegno della ricerca, le informazioni sulla caratterizzazione degli isolati del virus sono limitate ai geni principali. Ancora in fase preliminare sono anche gli studi sull' espressione genica a parte un recente lavoro su piante di lima messicana in risposta a due differenti ceppi di CTV. Questo studio ha riguardato la risposta fenotipica di indicatrici diverse, dopo inoculazione con un isolato virulento di CTV e le connesse modificazioni dell'espressione genica in arancio amaro, lima messicana, pompelmo Duncan, cedro Etrog e alemow. L'isolato utilizzato e' stato selezionato nel corso di indagini preliminari. Dopo la caratterizzazione con test biologici su piante indicatrici le analisi molecolari hanno permesso di concludere che si tratta di un isolato con un 99% di identita' nucleotidica con alcuni ceppi del Sud America (BaraoB, Val-CB e C271-2), verosimilmente appartenente al biogruppo 4. Le relazioni che il virus stabilisce con la pianta ospite sono state studiate attraverso una ricerca mirata ad accertare le modificazioni del profilo genico sulle piante sopra indicate inoculate sperimentalmente. Allo scopo e' stato utilizzanta la tecnica del reverse northern blot con specifiche sonde, la real time e la tecnica espressione differenziale dell' RNA messaggero (DDRT-PCR). Dopo una prima fase dedicata alla ricerca bibliografica sull' uso di tecniche molecolari per lo studio della modulazione genica in piante di agrumi, con riferimento a stress biotici e abiotici, sono state valutate le differenze tra piante di arancio amaro inoculate con l'isolato di CTV selezionato (SG29) e piante sane mediante reverse Northern blot, utilizzando sonde ricavate da una ricerca sulle infezioni di Citrus exocortis viroid (CEVd) in piante di cedro Etrog. Successivamente mediante real time PCR quantitativa sono stati selezionati sette geni, risultati differenzialmente espressi in arancio amaro, al fine di valutarne la modulazione in cinque specie di agrumi (arancio amaro, lima messicana, cedro, pompelmo e alemow) inoculati con CTV SG29. E' stata infine effettuata l'analisi differenziale dell' RNA messaggero in semenzali di arancio amaro inoculati con CTV SG29. Le analisi real time PCR hanno messo in evidenza che nei semenzali di arancio amaro, il gene della metallotioneina (MT), il regolatore del sileziamento genico (rgs-CaM) e il gene COSTANS-like, risultavano sovra espressi; di contro l'espressione dell' EREBP e del gene della perossidasi (PRX) mostravano un differente comportamento risultando sotto espressi. I geni codificanti per l'alcool deidrogenasi (ADH) e la permeasi degli amminoacidi, risultavano essere rispettivamente sotto e sovra espressi, mentre i geni per l' ADH e per la PRX, coinvolti nella risposta generale ai fattori di stress, si mostravano sotto espressi in tutti gli ospiti saggiati. Viceversa, rgs-CaM, AP e CLP erano sotto espressi nel cedro Etrog, nel pompelmo e nell'arancio dolce e sovra espressi nell' arancio amaro. La sovra espressione dell' EREBP, era presente solamente nel cedro Etrog e nell' arancio dolce, mentre MT era indotto solo nell'arancio amaro e nell' arancio dolce. Nella lima messicana, cosi come nei semenzali di arancio amaro, l' infezione di CTV ha indotto la sotto espressione di tutti i geni selezionati eccetto il gene rgs-CaM che risultava drasticamente sovra espresso. Dal momento che entrambi gli ospiti sono suscettibili a CTV SG29 e reagiscono con sintomi molto gravi, si ipotizza che l'azione dell' rgs-CaM come soppressore del silenziamento genico sia specie-specifico e che CTV induca fortemente la sua espressione nelle piante suscettibili, riuscendo ad evadere l'attivita' di silenziamento dell' RNA. L'analisi differenziale (DDRT-PCR) ha permesso di individuare l' alterazione di altri 4 geni (up e down) a seguito dell'inoculazione con CTV. Due di essi mostrano una elevata omologia di sequenza con 2 diverse sequenze EST di Citrus sinensis la cui funzione risulta pero' sconosciuta, la terza e' altamente omologa ad un retrotrasposone di Arabidopsis thaliana, il cui ruolo in condizioni di stress biotici e abiotici e' largamente riportato in letteratura. L' ultimo trascritto, che risulta invece essere regolato negativamente, codifica per una proteina del citocromo P450.

The research concerns one of the most important limiting factor of the citriculture worldwide, the tristeza disease, caused by the Citrus tristeza virus (CTV). Despite the efforts made by the research many informations are still lacking, being available only some data concerning few genes. Still in a preliminary stage are the studies about the gene modulation after the infection, a part a recent paper on the Mexican lime response to infection by two CTV isolates. The study has investigated the phenotypic response of some indicators plants inoculated with a severe isolate of CTV and the gene expression modification connected. In sour orange, mexican lime, Duncan grapefruit, sweet orange and Etrog citron. The CTV isolate was selected during a preliminar survey, characterized with biological tests, as well with molecular analysis. According to the results the isolate has 99% identity with some strains of South America, nomely Barao B, Val-CB and C271-2, likely belonging to biogroup 4. The relations between CTV and host plants have been investigated thought a study of the gene patterns of inoculated sour orange. To this aim the reverse Northern blot with specific probes, the real time PCR and the differential display analysis of m-RNA, have been undertaken. After a critical literature review on the molecular techniques used to study the gene modulation in citrus trees affected by biotic or abiotic stress, the differences between sour orange CTV infected or not, were evaluated by Reverse Northern Blot, using probes obtained in a previous research Etrog citron infected with Citrus exocortis viroide (CEVd). Seven genes differently expressed in sour orange were selected to evaluate their modulation by reverse transcriptase quantitative real time PCR in five citrus species (sour orange, mexican lime, citron, grapefruit and alemow) inoculated with CTV SG29. A messenger RNA differential display RT-PCR analysis (DDRT-PCR) of sour orange seedlings inoculated with the viral isolate CTV SG29 in comparison with healthy controls, was also carried out for identifying further differentially expressed. In sour orange seedlings, quantitative real time PCR revealed that genes codifying for metallothionein (MT), regulator of gene silencingà à à ¢ calmodulin-like protein (rgs-CaM) suppressor of RNA silencing, and CONSTANS-like (CLP) were up regulated, as observed in Northern blot analysis; in contrast, the expression of ethylene-responsive binding protein (EREBP) and peroxidase (PRX) genes showed a different behavior resulting down regulated. Alcohol dehydrogenase (ADH) and aminoacid permease (AP) genes, not detected by Northern, resulted to be down and up regulated, respectively. ADH and PRX genes, involved in general response to stress factors, exhibited the same pattern of expression (down regulation) in all citrus hosts tested. On the contrary, rgs-CaM, AP and CLP were down regulated in Etrog citron, grapefruit and sweet orange and over expressed in sour orange. Up regulation of EREBP occurred only in Etrog citron and in sweet orange, whereas MT is induced only in sour orange and sweet orange. Interestingly, CTV infection in Mexican lime as well as on sour orange seedling induced the down regulation of all the selected genes, but the rgs-CaM was drastically over expressed. Since both hosts are susceptible to CTV S29 and showed very severe symptoms, the hypothesis is advanced that rgs-CaM may act as host specific RNA silencing suppressor and CTV strongly induces its expression in susceptible plants, evading RNA silencing activity. Four new transcripts were identified in the first fingerprints obtained. Three of them are positive regulated in response to CTV infection, two show high sequence similarity with two different EST of Citrus sinensis, whose biological function is unknown, the third one shows sequence similarity with a retrotransponson of Arabidopsis thaliana, whose role under conditions of biotic and abiotic stress is largely reported in literature. The last transcript, which is negatively regulated, encodes a protein belonging to the family of cytochrome P 450.