Valutazione dei principali parametri genetici, biochimici e molecolari in pazienti astenozoospermici

Abstract

Introduzione ed obiettivi: L'astenozoospermia (motilita' grado a+b <50% o motilita' grado a <25%) e' di frequente riscontro nei pazienti infertili e pone spesso difficolta' nell'identificazione della sua insorgenza e di conseguenza per il suo trattamento. L'astenozoospermia puo' essere distinta in: complessa e semplice. Quella complessa e' associata ad alterazione degli altri parametri del liquido seminale (oligozoospermia, teratozoospermia e/o necrozoospermia). Quella semplice e' dovuta a varie cause che possono essere distinte in: anatomiche, flogistiche/infettive, da alterazione dei parametri reologici del liquido seminale, da alterazioni chimiche, biochimiche o del DNA mitocondriale e immunologiche. La motilita' dello spermatozoo si realizza grazie al processo di fosforilazione ossidativa che produce le molecole di ATP necessarie al movimento nemaspermico. La membrana interna mitocondriale presenta 5 sistemi enzimatici ossidativi che generando un potenziale di membrana, generano molecole di ATP. Le proteine del complesso enzimatico sono codificate da geni presenti nel mt-DNA. Quindi qualsiasi mutazione genica causa ridotta disponibilita' energetica, ovvero, ridotto potenziale di membrana, riduzione della motilita' e quindi della fertilita' e percio' astenozoospermia (Marchetti et al., 2002). Recentemente, e' stato dimostrato che pazienti con alterazioni dei parametri del liquido seminale (in particolare quelli con astenozoospermia severa) sottoposti a fecondazione assistita hanno un aumento significativo del numero di copie del mt-DNA e una riduzione significativa della sua integrita' rispetto a soggetti con parametri spermatici normali (Song & Lewis, 2008). Pertanto scopo di questo lavoro e' stato quello di valutare l'integrita' e il numero di copie del DNA mitocondriale negli spermatozoi di pazienti con astenozoospermia isolata e in soggetti normozoospermici come popolazione di controllo. Inoltre, i mitocondri possono regolare l'apoptosi cellulare mediante il rilascio del citocromo C e di altri fattori che inducono apoptosi, influendo nel processo di spermatogenesi e causando la frammentazione del DNA nucleare dei soggetti infertili (Zanzami et al., 1996). Pertanto lo studio dellà ¢ apoptosi e della frammentazione del DNA nucleare sono state incluse nelle due popolazioni in studio. Inoltre, recentemente, studi riguardante il ruolo dello stress ossidativo nellà ¢ infertilita' maschile hanno mostrato che uomini infertili presentano elevati livelli di sperm-derived reactive oxygen species (ROS) (Barbieri et al., 1999; Hendin et al., 1999; Pasqualotto et al., 2000; Zini et al., 2000; Agarwal et al., 2003; Meucci et al., 2003). I ROS sono prodotti dai leucociti e dagli stessi spermatozoi. Livelli fisiologici di ROS nel liquido seminale sono essenziali per la regolazione della normale funzione spermatica (capacitazione, reazione acrosomiale e fusione oocita-spermatozoo). L'iperproduzione di ROS, quale quella che si ha in corso di leucocitospermia, puo' superare i meccanismi di difesa antiossidanti degli spermatozoi con aumento dello stress ossidativo nel plasma seminale (Cocuzza et al., 2007). Tutto cio' e' in grado di provocare danni all'integrita' del DNA e/o della cromatina, danni all'integrita' della membrana citoplasmatica, in quanto questa essendo costituita da grandi quantita' d'acidi polinsaturi oleici (PUFA), e' soggetta all'azione perossidasica dei ROS, e alterazione della motilita' nemaspermica (Fraga et al.,1996; Irvine et al., 2000; Saleh and Agarwal, 2002; Wang et al.,2003; Moustafa et al., 2004). A tal fine e' stato inclusa nel lavoro anche la valutazione dei ROS quale marcatore diretto di danno biochimico e indiretto di danno genetico. Materiali e metodi: Sui pazienti adeguatamente selezionati e' stato eseguito l'esame del liquido seminale, secondo criteri WHO. In questo studio sono stati arruolati 18 pazienti astenozoospermici con una motilita' nemaspermica progressiva (a+b) à ¢ à ¤20% e con motilita' di tipo c à ¢ à ¥50% e 5 soggetti normozoospermici (secondo i criteri della WHO, 1999) (gruppo di controllo). Mediante analisi citofluorimetrica (EPICS XL Coulter Electronics, IL, Italia) sono stati valutati in entrambi i gruppi in studio i seguenti parametri: 1) Valutazione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP) degli spermatozoi, indice precoce di apoptosi , mediante fluorocromo JC-1; 2) Valutazione del grado di compattazione della cromatina degli spermatozoi mediante ioduro di propidio (PI ) (Sigma Chemical, Milano, Italia): 3) Esternalizzazione della fosfatidil serina (PS) negli spermatozoi , indice precoce di apoptosi, mediante annessina V; 4) Frammentazione del DNA degli spermatozoi mediante saggio TUNEL. La valutazione dei ROS e' stata eseguita in chemioluminescenza (LB9505 Luminometer, Berthold). L'integrita' del DNA mitocondriale e' stata valutata mediante Long PCR su DNA estratto da spermatozoi, utilizzando AccuPrime Pfx DNA polymerase (Invitrogen) per amplificare circa la meta' del genoma mitocondriale (8.7 kb). I prodotti PCR cosi' ottenuti sono stati visualizzati su gel di agarosio 0.8% e l'intensita' delle bande di 8.7 kb sono state misurate dopo 30 cicli di reazione, come precedentemente riportato (GJ Song and V Lewis, Fertility and Sterility, 2008). Risultati: I risultati ottenuti dimostrano che i pazienti con astenozoospermia hanno una percentuale significativamente piu' elevata di spermatozoi con basso MMP rispetto ai soggetti di controllo, mentre là ¢ esternalizzazione della PS, l'alterazione della condensazione della cromatina e la frammentazione del DNA non risulta essere cosi' significativa tra i due gruppi. La Long PCR ha mostrato che 22 pazienti con astenozoospermia presentano delezioni multiple e dunque scarsa integrita' del DNA mitocondriale rispetto ai soggetti normozoospermici. Il numero di copie di mt-DNA e' risultato maggiore rispetto al gruppo di controllo. Infine, i pazienti con astenozoospermia avevano una produzione di ROS significativamente piu' elevata rispetto ai controlli sia in condizione basale che dopo stimolo con fMLP e soprattutto con PMA.