Study of fluoroquinolone resistance in Lactobacillus spp.

Abstract

Obiettivi della ricerca e risultati. 244 ceppi in precedenza classificati come Lactobacillus spp., di origine vaginale e appartenenti alla batterioteca del Dipartimento di Scienze Bio-Mediche sez. Microbiologia dell'Università degli studi di Catania, sono stati caratterizzati a livello di specie mediante un approccio di tipo polifasico. Tale approccio prevede sia l'isolamento su terreni selettivi, sia l'uso di tecniche genotipiche:16S-RFLP, two steps multiplex PCR e tuf gene PCR per la discriminazione di L. paracasei-L.rhamnosus. Sono stati determinati i profili di sensibilità per quattro fluoroquinoloni: ciprofloxacina, levofloxacina, ofloxacina e ulifloxacina. In particolare, sono stati studiati i meccanismi di resistenza genotipica di quattro ceppi di L. fermentum che hanno mostrato ridotta sensibilità in vitro o resistenza verso ciprofloxacina (assumendo come resistenti, i ceppi con MIC maggiore o uguale a 4 µg/mL). Il primo meccanismo di resistenza ipotizzato coinvolge le mutazioni presenti a livello delle regioni QRDR(Quinolone Resistance Determining Regions) dei geni delle subunità della DNA girasi e della topoisomerasi IV , per individuare tali mutazioni sono state amplificate le QRDR dei geni parC e gyrA, delle rispettive subunità della Topoisomerasi IV e della DNA girasi, bersagli farmacologici dei chinoloni. I risultati del sequenziamento hanno evidenziato la presenza di mutazioni nucleotidiche, che però non hanno determinato variazioni nella sequenza aminoacidica. Tale risultato è in linea con quanto descritto nel 2003. da Fukaoo et al., i quali hanno dimostrato l assenza di modificazioni a carico dei geni gyrA e parC , quindi lo studio si è orientato alla ricerca di meccanismi di efflusso mediate da pompe MDR (Multi Drug Resistance). A tal fine è stato misurato l andamento delle concentrazioni intracellulari in un intervallo di tempo compreso tra zero e quattro ore; la variazione delle concentrazioni di ciprofloxacina è stata analizzata sfruttando i valori di assorbimento massimo a 275 nm da cui scaturisce un picco di emissione a 447 nm. Lo studio fenotipico condotto sia con disaccoppianti (CCC carbonil-cianil-clorofenil idrazone), sia con bloccanti dei canali tipo MDR (Verapamil e reserpina), hanno rivelato una riduzione dei valori di MIC per ciprofloxacina (riduzione di due diluizioni). L'analisi genomica comparata condotta su GenBank ha mostrato che in L. fermentum ATCC 14931 sono presenti due proteine ipotetiche: una (GenBank ref.ZP_03944345.1) appartenente alla famiglia MFS (Major Facilitator Superfamily) che presenta un omologia del 98% con NorA (GenBank ref.CCE58495.1) proteina responsabile dell'efflusso dei chinoloni in S. aureus; un altra (GenBank ref.ZP_03944509.1), appartenente alla famiglia ABC, che presenta una omologia del 90% con LmrA (GenBank ref.YP_005868060.1) responsabile dell efflusso dei chinoloni in L. lactis.