Indagini, sequenziamento e studio del flusso genico del PepMV in Sicilia e nuovo metodo diagnostico

Abstract

Dal 2009 ad oggi diverse sono state le osservazioni e le segnalazioni di piante di pomodoro in serra affette da sintomi riferibili a PepMV. L area maggiormente interessata dalla presenza del patogeno è la provincia di Ragusa che ha i più elevati investimenti in serre. Lo scopo della mia tesi di dottorato ha interessato: le indagini di campo sull infezione e diffusione di PepMV nell area della provincia di Ragusa; le prove di trasmissione di PepMV mediante Bombi; le indagini sulla presenza di PepMV su specie diverse (coltivate e spontanee); i saggi per accertare la presenza di PepMV nei semi di pomodoro; le prove di trasmissione in piante di pomodoro attraverso il seme; la ndividuazione dei più importanti virus a RNA che infettano le piante di pomodoro; il sequenziamento di un isolato di PepMV riscontrato in Sicilia; lo studio del flusso genico e della dispersione di PepMV in Sicilia; la diagnosi del PepMV attraverso un nuovo metodo di rilevamento basato sull'ibridazione di flusso di impronte su membrana. I nostri risultati mostrano l elevata e rapida diffusione del virus del PepMV in provincia di Ragusa. I danni economici provocati dal PepMV sono risultati ingenti in tutte le provincie sia per l elevata diffusione del virus che per i danni provocati: in molte serre la perdita della produzione era quasi del 100%. La prova per accertare la trasmissione di PepMV attraverso i bombi ha dimostrato che questi insetti pur favorendo l impollinazione dei fiori, e quindi incrementando la produttività, dall altro favoriscono la diffusione dei virioni superando gli effetti positivi dell impollinazione. Le prove per accertare la presenza dei virioni di PepMV nei semi hanno dimostrato, mediante test ELISA, la presenza del virus. Per quanto riguarda la trasmissione di PepMV in piante di pomodoro attraverso il seme, nessuna delle piantine ottenute dai semi infetti ha mostrato sintomi afferenti al PepMV, inoltre nessuna delle piante è risultata infetta. Ciò potrebbe essere collegato al modesto numero di piante saggiate. In letteratura si riporta che la trasmissione per seme è spesso inferiore all 1%. Al fine di migliorare la tecnica di saggio nella diagnosi di PepMV è stata messa a punto una tecnica più veloce per capire se potesse essere efficace da poter essere utilizzata in diagnosi tradizionale. La tecnica multiplex ci consente in tempi brevi di saggiare 7 virus contemporaneamente. Ciò è molto importante poiché infezioni miste sono sempre presenti sia nelle coltivazioni in serre sia in pieno campo. Le indagini per accertare la dispersione del virus fanno notare che dal 2011 al 2013 la malattia ha avuto un progressivo aumento, infatti la percentuale di piante infette era circa il 13% nel 2011, mentre è aumentata al 37% nel 2012 e nel 2013 venne fino a circa il 63%. La procedura mediante la ibridazione di flusso consente il rilevamento di PepMV nonostante l'elevata diversità degli isolati e pertanto, questo metodo risulta valido per la maggior parte virus vegetali. Le impronte dei tessuti possono essere preparati in campo, conservati a temperatura ambiente fino a due anni e spediti altrove per l'analisi. Questa tecnica rappresenta una nuova procedura basata sull ibridazione di flusso per impronte su membrane ed è stata sviluppata per un rapido, preciso e sensibile rilevamento di PepMV. Può essere facilmente adattata ad altri virus vegetali e probabilmente ad altri patogeni delle piante. Questa è probabilmente la tecnica diagnostica più veloce e più semplice che consenta la diagnosi simultanea di un gran numero di campioni, combinando analisi di impronte di tessuto vegetale, risparmiando tempo e lavoro per la preparazione dell'estratto, nonché una procedura di ibridazione ultra rapida di 15-30 minuti.