Ruolo dell Inotuzumab Ozogamicin (CMC-544) nell induzione dell apoptosi in cellule CD22-positive di patologie linfoproliferative

Abstract

In questo progetto di ricerca, abbiamo descritto i meccanismi molecolari innescati dall'Inotuzumab Ozogamicina (CMC-544), un anticorpo anti-CD22 coniugato con la calichemicina, in linee immortalizzate ed in colture primarie di cellule linfoidi derivate da patologie linfoproliferative CD22-positive. Abbiamo utilizzato due linee cellulari derivate da linfoma di Burkitt (BL-2, RAJI, NAMALWA), una linea derivata da leucemia a precursori linfoidi B (SUP-B15) e una linea derivata da leucemia mieloide acuta (HL-60) come linea cellulare di controllo. Le cellule sono state trattate con il CMC-544 o il Gemtuzumab Ozogamicina (CMA-676), un anticorpo anti-CD33 coniugato con la calichemicina. Le linee cellulari BL-2 e SUP-B15 mostrano valori di IC50 per il CMC-544 significativamente piu' bassi rispetto a quelli ottenuti dopo trattamento con il CMA-676. Tuttavia, le RAJI e le NAMALWA presentano valori di IC50 simili per entrambi gli immunoconiugati, anche se presentano una bassa percentuale dell'antigene di superficie CD33. Inoltre, mentre le BL-2 e le SUP-B15 sopravvissute al trattamento per 48 ore con il CMC-544 sono arrestate in fase G2/M del ciclo cellulare, le RAJI e le NAMALWA - che presentano una mutazione nella sequenza amminoacidica della proteina p53 non solo non sono in grado di bloccarsi, ma l'esposizione all'immunoconiugato genera una popolazione poliploide. Nonostante cio', gli esperimenti di citofluorimetria, per valutare la distribuzione del ciclo cellulare, dimostrano che il trattamento con il CMC-544 per 12 ore induce un arresto in fase G2/M p53-indipendente in tutte le linee cellulari CD22-positive. Quando abbiamo ripetuto gli stessi esperimenti usando una combinazione sequenziale del CMC-544 e dellà à à à à ¢ UCN-01, un inibitore di ChK2, abbiamo osservato un significativo incremento della morte cellulare. Il trattamento per 48 ore con il CMC-544 determina un arresto in fase G2/M del ciclo cellulare solo nelle BL-2 e SUP-B15, un evento fortemente ridotto dopo esposizione all'UCN-01. Tuttavia, le RAJI e le NAMALWA à à à à à ¢ mancando del blocco in fase G2/M dopo 48 ore d'esposizione al CMC-544 - non rispondono al trattamento con l'UCN-01. Nonostante cio', l'espressione ectopica di p53 wild-type nelle NAMALWA le ha rese sensibili al trattamento con il CMC-544 ed ha generato un incremento della morte cellulare. Abbiamo, inoltre, confermato il valore predittivo dello status di p53 nel determinare la sensibilita' al trattamento con il CMC-544 anche in colture primarie derivate da pazienti affetti da patologie linfoproliferative CD22-positive. In conclusione, il CMC-544 mostra un alto potenziale terapeutico in cellule immortalizzate ed in linee primarie linfoidi CD22-positive. Lo status mutazionale della proteina p53 potrebbe rappresentare un marcatore molecolare di risposta al CMC-544 sia in vitro che in vivo. Inoltre, la combinazione con un inibitore della protein-chinasi ChK2 potrebbe ripristinare l'attivita' dell'immunoconiugato in pazienti con patologie linfoproliferative CD22-positive che presentano mutazioni nella proteina p53.